Premisset bak Sister Princess er at en vanlig ung mann (spilleren) er skapt til å leve med tolv elskelige småsøstre, hver med sine særegne særheter og personligheter. Spillerne har omtrent en måned å tilbringe sammen med søstrene, og hver dag er delt opp i tre segmenter: først er fritidsperioden før middag, etterfulgt av perioden etter lunsj og avsluttes med en annen periode før sengetid. På dagtid kan spilleren velge hvilken av jentene han ønsker å eskortere til skolen, om noen. Perioden etter lunsj er lik den om morgenen, med flere valg som lar spilleren gå til forskjellige steder i byen i tillegg til å gå hjem med en av jentene. Hver kveld før sengetid vil spilleren få lov til å sjekke e-posten sin og sende svar. Ettersom spilleren fortsetter å samhandle med søstrene, vil reaksjonene deres på storebroren endres tilsvarende frem til slutten. Det er to forskjellige avslutninger for hver søster: den normale avslutningen og enden "ikke-blodsrelasjon". Som navnet antyder, avslører den spesielle slutten at bror-karakteren og søsteren faktisk ikke er i slekt med blod. Når det gjelder noen av de eldre søstrene, kan dette føre til at hovedpersonen og "søsteren" gifter seg med hverandre.