Romvesener har landet i futuristiske Los Angeles, og det er opp til hertugen å bringe smerten og vise dem døren. Etter de første oppføringene av sidescrollende plattformspill, introduserer Duke Nukem 3D et førstepersonsperspektiv til serien og gjør spillet om til et fullverdig skytespill med 2.5D-grafikk. Dukes arsenal inkluderer pistoler, rørbomber, lasertrip-miner, Nordenfelt-våpen, en kjedepistol og forskjellige rakettkastere, men også hans mektige fot for å sparke fiender. Spillet har et høyt nivå av interaktivitet. Mange gjenstander i miljøet kan bli ødelagt eller samhandlet med, som biljardbord, arkademaskiner, glass, lysbrytere og sikkerhetskameraer. Hovedpersonen er også i stand til å gi strippere en dollar for å få dem til å fjerne toppen.