Gjør deg klar for en historie så episk at den bare kan utfolde seg i korridorene til verdens største museum – Smithsonian Institution. Museumsvakt-entreprenøren Larry Daley oppdager at favorittutstillingene hans, og noen av hans beste venner, fra New Yorks Natural History Museum blir sendt til arkivene på Smithsonian. Larry får et nødanrop fra miniatyrcowboyen Jedediah, som rapporterer at den egyptiske herskeren Kahmunrah og en trio av grufulle håndlangere – nemlig Ivan the Terrible, Napoleon og Al Capone – planlegger å ta over museet, deretter verden. På vei til nasjonens hovedstad er Larry tydelig i over hodet. Men med noen imponerende nye venner, inkludert den ukueliggelige Amelia Earhart, sammen med kjente venner Teddy Roosevelt og Octavius, vil Larry ikke stoppe noe for å gjenopprette Smithsonian før daggry.