I Nano Assault sprenger spillere seg gjennom 32 vridde celletrinn og mørke verdener med røffe landskap som justerer i vanskelighetsgrad basert på spillerens ferdighetsnivå. Forbered deg på å kjempe mot og beseire ekstreme fiender, inkludert Black Nucleus, Hyper Blobs og Spore Plants ved å bruke kraftige stråler, energiske bomber og andre opplåsbare angrepsvåpen. For å sikre vellykkede oppdrag kan spillere klone og repawne seg selv for å fortsette reisen når som helst. Spesielle funksjoner inkluderer Missions Mode, en opplåsbar cellescene i arkadestil der spillere må slå klokken ved å ødelegge flest fiender, og Hall of Fame, en poengtavle for skryterettigheter der spillere kan publisere og sammenligne poeng på høyt nivå med venner. I tillegg vil spillere kunne bruke StreetPass-funksjonen til å bytte ulåst innhold.